دسته : دامپزشکی
فرمت فایل : word
حجم فایل : 40 KB
تعداد صفحات : 62
بازدیدها : 8801
برچسبها : موشهای Balac
مبلغ : 2000 تومان
خرید این فایلهدف از این مقاله تحقیقی بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.
1- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector
2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جدا شده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12
3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector
4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39
5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector
6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین
7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C
8- سنجشهای ایمونولوژیک
باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده شده اند بترتیب زیر می باشند:
باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالکی سویه
اشریشیالکی سویه BL21 اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss
پلاسمیرها: PGEX4T1 PRT 28a SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3
- جداسازی کروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:
برای تکثیر جداسازی ژنهای L7/L12 و P39 ابتدا کروموزوم باکتری جداسازی گردید.
مواد:
بافر TE:
Tris Hel10mm
EDTA1.0mm
PH بافر را پس از تهیه برروی 8 تنظیم می نمائیم.
پروتئیناز K:
CTAB/NaCl:
Nacl4.1gr
CTAB10gr
DDW100ml (Final Volume)
روش:
ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم. پس 48 تا 72 ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند. بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است:
1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.
2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و به مدت یک ساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.
3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl به میزان Ml80 اضافه کرده و به مدت 10 دققیق در0C65 انکوبه می کنیم.
4- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط به مدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.
5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل کلروفرم ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.
6- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می کنیم. پس از چند دقیقه DNA کروموزومی ته نشین شده که می توان بات یک پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.
7- رسوب DNA کروموزومی را با الکل 70% شستشو داده و پس از خشک شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.
....
خرید و دانلود آنی فایل